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包納米蟲(Bona)核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)說明書發(fā)表時間:2020-04-10 15:16 包納米蟲(Bona)核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)說明書 產(chǎn)品僅用于科研產(chǎn)品名稱:包納米蟲(Bona)核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法) 規(guī)格:48T 0.1PCR管/48T 0.2PCR管 技術(shù)服務(wù)內(nèi)容: 實驗步驟包括RNA提取、反轉(zhuǎn)錄、PCR和瓊脂糖凝膠電泳,以軟件分析電泳條帶的灰度值(IOD值),通過與內(nèi)參基因的灰度值比較,判斷目的mRNA的相對表達量。 使用方法: 一、樣品 RNA 的制備 1、用自選方法抽提病毒樣品 RNA。注意:可以選用本公司**的一管式病毒 RNAout 2、或柱式病毒 RNAout。 二:RT(逆轉(zhuǎn)錄)反應(yīng)合成 cDNA 1. 按下表配制 RT 反應(yīng)體系(20 μL 體系) 2. 70℃保溫 5 分鐘變性模板后立即冰浴。 3. 嚴格按順序加入 6μL RT Buffer(含 dNTP)和 2μL MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶(含 RI), 反應(yīng)終體積為 20μL。 4. 42℃保溫 60 分鐘。此步為 RT 反應(yīng)。 5. 70℃保溫 10 分鐘以終止反應(yīng),然后放置在冰上待用。合成的 cDNA 可以直接作為 PCR 模板使用,丌需要純化。 三、操作方法 1樣本的處理(在樣本制備區(qū)進行): 1.1、取 n 個滅菌的 1.5 mL Eppendorf 管,其中 n 為被檢樣品與陰性對照的和(陽性對照、陰性對照在試劑盒中已標出),做標記。(注:試劑盒中的陽性對照直接作為 PCR 檢測的模板,無需提取核酸) 1.2、每管加入 600 ?L 裂解液,分別加入被檢樣本和陰性對照各 200 ?L,一份樣本換用一個吸頭,再加入 200 ?L 氯仿,混勻器上振蕩混勻 5 s(不能過于強烈,以免產(chǎn)生乳化層,也可以用手顛倒混勻),于 4℃ 12 000 r/min 離心 15 min。 1.3、取與1.1 相同數(shù)量滅菌的 1.5 mL Eppendorf 管,加入 500 ?L 異丙醇(-20℃預(yù)冷), 做標記。吸取1.2 各管中的上清液轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的管中,上清液應(yīng)至少吸取 500?L,不能吸出中間層,顛倒混勻。 1.4、于 4 ℃、12 000 r/min 離心 15 min(Eppendorf 管開口保持朝離心機轉(zhuǎn)軸方向放置),小心倒去上清,倒置于吸水紙上,沾干液體(不同樣品須在吸水紙不同地方沾干);加入 600 ?L 75% 乙醇,顛倒洗滌。1.5、于 4 ℃、12 000 r/min 離心 10 min(Eppendorf 管開口保持朝離心機轉(zhuǎn)軸方向放置),小心倒去上清,倒置于吸水紙上,盡量沾干液體(不同樣品須在吸水紙不同地方沾干)。 1.6、4 000 r/min 離心 10s(Eppendorf 管開口保持朝離心機轉(zhuǎn)軸方向放置),將管壁上的殘余液體甩到管底部,小心倒去上清,用微量加樣器將其吸干,一份樣本換用一個吸頭,吸頭不要碰到有沉淀一面,室溫干燥 3 min,不能過于干燥,以免 RNA 不溶。 1.7、加入 11 ?L DEPC 水,輕輕混勻,溶解管壁上的 RNA,2 000 r/min 離心 5 s,冰上保存?zhèn)溆?。提取?RNA 須在 2 h 內(nèi)進行 PCR 擴增;若需長期保存須放置-70 ℃冰箱內(nèi)。 【也可參照《病毒 RNA 柱式提取試劑盒說明書》(貨號:HB-QPCR-01)使用,更方便快捷提取核酸】。 注:提取的 RNA 須在 2 h 內(nèi)進行 PCR 擴增;若需長期保存須放置-70 ℃冰箱內(nèi) 實驗注意事項: 1)RT-PCR可以檢測組織、細胞、血液、細菌等很多材料,不同的樣本有不同要求,實驗前請充分溝通確認實驗方案和樣本情況; 2)客戶盡可能提供實驗的背景信息、物種、基因準確的名稱和ID號; 3)客戶盡量不要提供DNA或RNA樣品。 4)樣本保存于液氮或干冰,也可以保存于Trizol液中。實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團,利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程,*通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。實時熒光定量PCR的化學原理包括探針類和非探針類兩類,探針類是利用與靶細胞序列特異性雜交的探針來指示擴增產(chǎn)物的增加,非探針類是利用熒光染料或者特異性設(shè)計的引物來指示擴增的增加。運用該技術(shù)可以對DNA、RNA樣品進行定量(包括*定量和相對定量)和定性分析。 主要服務(wù):DNA或RNA的*定量分析、基因表達差異分析、基因分型。 主要技術(shù):引物設(shè)計、RNA提取、cDNA合成、qPCR。 |
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